生物实验常用溶液的配制方法（液体培养基的配制步骤）

一、DNA电泳相关：

1、DNA电泳缓冲液：

（1）Tris-乙酸（TAE）缓冲液：TAE较为常用，且价格低，但其缓冲能力较弱。所以TAE电泳需要蠕动泵使两极贮液槽进行液体循环，而且TAE需要经常更新；且要加入EDTA，目的在于鳌合二价离子，抑制DNase，以保护DNA。

① TAE使用液：

1×：40mmol/L Tris-乙酸

1mmol/L EDTA

② TAE贮存液（每L）：

50×：242g Tris碱

57.1ml 冰乙酸

100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）

（2）Tris-硼酸（TBE）缓冲液：

① TBE使用液：

0.5×：0.045mol/L Tris-硼酸

1mmol/L EDTA

② TBE贮存液（每L）：

5×： 54g Tris碱

27.5ml 硼酸

20ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）

（3）Tris-磷酸（TPE）缓冲液：

① TPE使用液：

1×：90mmol/L Tris-磷酸

2mmol/L EDTA

② TPE贮存液（每L）：

10×：108g Tris碱

15.5ml 85%磷酸

40ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）

2、1%（线性DNA分子大小为400-6000）琼脂糖凝胶DNA电泳操作过程：

①制胶：按要求取1g琼脂糖加入1×TAE（或0.5×TAE）电泳缓冲液100ml，置于三角瓶中，在沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖溶解（一般中低火温，3-5min即可）；

②溶液冷却至60℃，加入EB至0.5μg/ml（2-3ml即可）,充分混匀；

③迅速倒入备好的胶模中；

④凝胶完全凝固后，小心移去梳子和封口胶带，将凝胶放入电泳槽中；

⑤加入能没过胶面1mm深的电泳缓冲液（TAE）；

⑥DNA样品与加样缓冲液（溴酚蓝）混合后，用微量移液吸头加样；

⑦盖上电泳槽并通电，使DNA向正极移动（黑极→红极），1-5V/cm（80V电压左右）进行电泳（30min左右）；

⑧电泳完毕，切断电源，取出凝胶于紫外投射光源下观察并拍照。

二、12％ SDS-PAGE 的相关溶液

1、5×加样缓冲液：

10% w/v SDS，10 mM DTT或β-巯基乙醇，20% v/v甘油，0.2M Tris-HCl pH 6.8，0.05% w/v 溴酚蓝。 （注意：将不含DTT的1×SDS凝胶上样缓冲液置于室温下储存，临用前从1mol/L DTT储液中添加到上述缓冲液中。）

5×Sample Buffer：

10% w/v SDS

10 mmol/L Dithiothreitol,or beta-mercapto-ethanol

20% v/v Glycerol

0.2 mol/L Tris-HCl pH 6.8

0.05% w/v Bromophenolblue

另：2×SDS 上样液缓冲液:

100mL溶液中含0.5mol/L Tris-HCl(pH=6.8) 20mL , SDS 4 g ,甘油20 mL , 溴酚蓝0.2 g ,DTT3g;

2、1×电泳缓冲液：

25 mM Tris-HCl pH 8.8，200 mM 甘氨酸，0.1% w/vSDS。

1×Running Buffer

25mmol/L Tris-HCl pH 8.8

200～250mmol/L Glycine（电泳级）（pH 8.3）

0.1% w/v SDS

可以配成5×贮存液，在900ml去离子水中溶解15.1gTris碱和94g甘氨酸，然后加入50ml 10%（m/v）电泳级SDS的贮存液，用去离子水补至1000ml即可。

3、分离胶配方：

H2O 10.5，1.5 M Tris-HCl pH8.8 7.5，20% w/v SDS 0.15，30% 丙烯酰胺 / 0.8% 亚甲双丙烯酰胺(/w/v) 12.0，10% w/v 过硫酸铵 15，TEMED 0.02（单位：mL，总体积25 mL）。 注：过硫酸铵会缓慢分解，故应每周新鲜配制，可用去离子水配制少量10%（m/v）储存液于4℃保存。

Running Gel Solution (mL) ：

H2O 10.2

1.5 mol/L Tris-HCl pH8.8 7.5

20% SDS (w/v) 0.15

Acrylamide/Bis-acrylamide (30%/0.8% w/v) 12.0

10% ammonium persulfate (w/v) 0.15

TEMED 0.02

4、积层胶配方(4% 丙烯酰胺)：

H2O 3.05，0.5 M Tris-HCl pH6.8 1.25，20% w/v SDS 0.025，30% 丙烯酰胺 / 0.8% 亚甲双丙烯酰胺(/w/v) 0.65，10% w/v过硫酸铵 0.025，TEMED 0.005（单位：mL，总体积5 mL）。

Stacking Gel Solution (4% Acrylamide) (mL)：

H2O 3.075

0.5 mol/L Tris-HCl pH6.8 1.25

20% SDS (w/v) 0.025

Acrylamide/Bis-acrylamide (30%/0.8% w/v) 0.67

10% ammonium persulfate (w/v) 0.025

TEMED 0.005

5、考马斯亮蓝染色液：

0.25 g考马斯亮蓝R250溶解于90 mL甲醇：水（1:1 v/v）和10 mL冰乙酸的混合液中，过滤除去颗粒状物质。（或考马斯亮蓝R-250 0.5g ,乙醇250mL ,乙酸110mL ,水740mL ,混匀;）

另：0.2％考马斯亮兰R-250染液：

甲醇 46.5ml

醋酸 7.0ml

考马斯亮兰 0.2g

蒸馏水 加至100ml

6、脱色液：

170 mL甲醇,加70 mL冰乙酸，加蒸馏水定容至1000 mL。

三、蛋白质纯化的相关溶液

1、超声破菌缓冲液：

20mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5mol/L NaCl、1mmol/L EDTA、1mg/mL溶菌酶

2、包涵体洗涤缓冲液：

20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton。

3、包涵体溶解缓冲液：

20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton。

4、Ni2+亲和层析柱纯化缓冲液：

结合缓冲液（pH7.8）：

20mmol/L 磷酸钠

500mmol/L NaCl

洗涤缓冲液（pH6.0）：

20mmol/L磷酸钠

500mmol/LNaCl

咪唑洗脱缓冲液（pH6.0）：

20mmol/L 磷酸钠

500mmol/L NaCl

在洗涤缓冲液（pH6.0）中加入适量3mol/L咪唑分别配成10mmol/L、50mmol/L 、100mmol/L和150 mmol/L的咪唑洗脱缓冲液。

Triton X-100(10% v/v)

酶和缓冲液：

DNase(1mg/ml)

溶菌酶

RNase(1mg/ml)

5、2％Triton X－100溶液：

量取2mlTriton X一100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M缓冲液98ml即可。

6、50％PEG(聚乙二醇Polyethyleneglycol mwl500)：

称取0.5克PEG，用前放入试管中在酒精灯火焰上熔化，加入等量37℃予热的MEM培养液，混匀，保温在37℃水浴中待用。

7、1％SDS(十二烷基硫酸钠Sodium dodecyl sulfate,SDS)：

SDS 10g

45％乙醇 100ml

8、1mol/LTris(三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液Trihydroxy methylaminomethane Tris/HCL)pH7.8：

Tris 12.114g

蒸馏水 lOOml

先将Tris溶于少量蒸馏水，用HCI调pH至7.8，然后加水至100ml

四、PH缓冲液的配制：

（1）磷酸缓冲盐溶液（PBS）：

① 137mmol/L NaCl

2.7mmol/L KCl

10mmol/L Na2HPO4

2mmol/L KH2PO4

用800ml蒸馏水溶解8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4。用HCl调节溶液的PH值至7.4，加水至1L。分装后在15psi（1.05kg/cm2）高压蒸汽灭菌20min，或过滤除菌，保存于室温。（注：PBS是一种通用试剂，值得指出的是上述列出的配方缺乏双价阳离子，如果需要，PBS可以补加成1mmol/L CaCl2和0.5mmol/L MgCl2）

② 0.01mol／LPBS(磷酸盐缓冲液Phosphate Buffer Saline，PBS)，pH7.2：

A：0.2mol／L磷酸氢二钠液(甲液)：

NaH2PO4·12H2O 35.814g

双蒸水 加至500ml

B：0.2mol／L磷酸二氢钠液(乙液):

NaH2PO4·2H2O 15.601g

双蒸水 加至500ml

取甲液36ml，乙液14ml和NaCl 8.2克，加双蒸水至1000ml。混匀待完全溶解分装，经高压灭菌后保存于4℃冰箱备用。

③ 1/15 mol/L PBS(磷酸缓冲液Phosphate Buffer Solution，PBS)：

甲液：1/15 mol/L Na2HPO4溶液

Na2HPO4 9.465g

蒸馏水 加至1000ml

乙液：l/15 mol/L KH2PO4溶液

KH2P04 9.07g

蒸馏水 加至1000m1

分装在棕色瓶内，于4℃冰箱中保存，用时甲、乙两液各按不同比例混合，即可得所需pH的缓冲液,见下表:

（2）10×Tris EDTA(TE):

①pH 7.4:

100mmol/L Tris-Cl(pH7.4)

10mmol/L EDTA(pH8.0)

②pH 7.6:

100mmol/L Tris-Cl(pH7.6)

10mmol/L EDTA(pH8.0)

③pH 8.0:

100mmol/L Tris-Cl(pH8.0)

10mmol/L EDTA(pH8.0)

分装后在15psi（1.05kg/cm2）高压蒸汽灭菌20min，保存于室温。

（3）Tris-Cl（1mol/L）:

用800ml蒸馏水溶解121.1gTris碱，加浓盐酸调pH 至所需值。

pH HCl

7.4 70ml

7.6 60ml

8.0 42ml

应使溶液冷至室温后，方可最后调定pH 值。加水定容至1L。分装后高压蒸汽灭菌。如果1mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃。并使用质量更好的Tris。Tris溶液的pH 值因温度而异，温度每升高1℃，pH 值大约降低0.03单位，0.05mol/L溶液在5℃，25℃和37℃时的pH 值分别为9.5，8.9和8.6。

（4）Tris缓冲盐溶液（TBS）：

用800ml蒸馏水溶解8g NaCl，0.2g KCl和3g Tris碱，加入0.015g酚红并用HCl调pH值至7.4，用蒸馏水定容至1L。分装后在15 psi（1.05 kg/cm2）高压下蒸汽灭菌20min，保存于室温。

五、常用缓冲液配制：

（1）碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液

贮备液A：0.2 mol/L碳酸钠（Na2CO3·H2O 24.8g配成1000ml）；

贮备液B：0.2 mol/L碳酸氢钠（NaHCO3 16.8g配成1000ml）。

x ml A液 + y ml B液稀释至200ml

（2）磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液

贮备液A：0.2 mol/L磷酸二氢钠（NaH2PO3·H2O 27.6g或NaH2PO3·2H2O 31.21g配成1000ml）；

贮备液B：0.2 mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO3·2H2O 35.61g或Na2HPO3·12H2O 71.64g配成1000ml）。

x ml A液 + y ml B液稀释至100ml

（3）Tris-HCl缓冲液

贮备液A：0.2 mol/L三羟甲氨基烷（Tris-ydroxy methyLamino methanne,C4H11NO3，24.2g配成1000ml）；

贮备液B：0.2 mol/L盐酸（浓HCl 17.1ml配成1000ml）。

50ml ml A液 + x ml B液稀释至200ml

（4）柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液

贮备液A：0.1 mol/L柠檬酸（C6H8O7，19.21g配成1000ml）；

贮备液B：0.1 mol/L柠檬酸钠（C6H5O7Na3·2H2O 29.41g配成1000ml）。

x ml A液 + y ml B液稀释至100ml

（5）醋酸-醋酸钠缓冲液

贮备液A：0.2 mol/L醋酸（冰醋酸11.55ml稀释至1000ml）；

贮备液B：0.2 mol/L醋酸钠（C2H2O2Na 16.4g或C2H2O2Na·3H2O 27g配成1000ml）。

x ml A液 + y ml B液稀释至1000ml

六、细胞培养和细胞融合溶液：

1、0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA混合消化液：

胰蛋白酶(Trypsin)粉 0.25g

EDTA粉 20.0mg

0.01mol／L PBS 100ml

先用少量PBS溶解胰蛋白酶，然后将EDTA粉末和剩下的液体加入混合，置37℃水浴中1小时左右(待彻底溶解，液体呈透明为止)，用G5抽滤，分装置4℃冰箱中保存。

2、Hanks液：

（1）原液

①原液甲：

NaCl 160g

KCl 8g

MgSO4·7H2O 2g

MgCI2·6H2O 2g

溶于800ml馏水中。

CaCl2(无水) 2.8g

溶于100ml蒸馏水中。

将两种液体混合后，加水至1000ml用滤纸滤过，再加2ml氯仿防腐，置4℃冰箱备用。

②原液乙：

Na2HPO4·12H2O 3.04g

KH2PO4 1.2g

葡萄糖 20.0g

溶于800ml蒸馏水中，用滤纸过滤，然后加0.5％酚红80ml，再加水至1000ml，最后加入2ml氯仿防腐，置4℃冰箱备用。

（2）使用液

甲乙两液各1份，双蒸水18份，混匀分装包扎好瓶口，经10磅15分钟高压灭菌后置4℃冰箱中保存。使用时用5.6％NaHCO3调pH值到所需要求。

3、LB培养基（Luria-Bertani培养基）：

每升培养基含有：

细菌培养用胰化蛋白胨（bacto-trytone） 10g

细菌培养用酵母提取物（bacto-yeast extract） 5g

氯化钠（NaCl） 10g

在950ml重蒸水中分别加入上述组分，摇动容器直至溶质完全溶解，用5mol/L氢氧化钠（NaOH）（约0.2ml）调节pH值至7.0，加入重蒸水定容至1L，在1.034×105Pa高压蒸汽灭菌20min。（液体培养基）

另：固体培养基（含有琼脂或琼脂糖的培养基）

按照上述配方配制液体培养基，高压灭菌前加入下列试剂中的一份：

细菌培养用琼脂（Bacto-Agar） 15g/L(铺制平板用)

细菌培养用琼脂（Bacto-Agar） 7g/L(配制顶层琼脂用)

琼脂糖 15g/L(铺制平板用)

琼脂糖 7g/L(配制顶层琼脂用)

在15psi（1.05kg/cm2）高压下灭菌20min。从高压锅取出培养基时应轻轻旋动以使溶解的琼脂或琼脂糖能够均匀分布在整个培养基溶液中。必须小心，此时培养基溶液可能过热，旋动液体可能会发生暴沸。应使培养基降温至50～60℃，方可加入不耐热的物质（如抗生素，加Amp的量为1:100）；为避免产生气泡，混匀培养基时应采用旋动的方式。然后可直接从烧瓶中倒置平板。90mm直径的培养皿每个需约30～50ml的培养基。如果平板上的培养基有气泡形成，可在琼脂或琼脂糖凝结前用本生煤气喷射灯灼烧培养基表面以除去之。设定颜色记号在相应平板的边缘作记号以区别不同的培养基。

培养基完全凝固后，应倒置平板并贮存于4℃备用。使用前1-2h应取出贮存的平板。如果平板是新鲜配制的，在37℃温育时会“发汗”，便会导致细菌菌落或噬菌体噬菌斑在平板表面扩散而增加交叉污染的机会。为避免这一问题，可以拭去平皿内部的冷凝水并把平板倒置，37℃温育数小时方予使用，也可以快甩一下平皿以除去冷凝水，为尽可能减少污染，除去盖上的水滴时，应把开盖的平板呈倒置状态拿着。

4、Amp：抗生素（氨苄青霉素），浓度50mg/ml（溶于水），温度-20℃，工作液（严密型质粒：20μg/ml；松弛型质粒60μg/ml）

5、IPTG：isopropyl-β-D-thiogalactoside(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，作为蛋白质诱导剂。母液1M/L，工作液1mM/L